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如何打造出藝術品般的免疫熒光圖像?

時間:2017年11月23日信息來源:本站原創點擊:

        每每看到那些藝術品般的細胞圖像,我們當然希望能親手創作一幅。然而,對于固定細胞的染色,并沒有理想的操作步驟,因此實驗過程少不了優化。免疫熒光實驗的染色過程一般分為六個步驟:樣品制備、固定、透化、封閉、抗體孵育和封片。在此,賽默飛世爾的技術專家Jason Kilgore給出了一些建議,能幫助您優化每個步驟,打造出一幅精美的藝術品。 

1. 樣品制備
        在培養過程中,使用正確的培養基、血清、溫度和CO2濃度是必不可少的。同時請記住,您的培養方式也要與您的成像平臺相契合,比如,正置顯微鏡通常需要蓋玻片上的細胞,而倒置顯微鏡能夠成像多孔板中的細胞。在開始免疫熒光操作之前,需要經常檢查細胞的健康狀況和匯合度。是否有足夠的細胞?它們的形態是否符合預期?  
        Tip #1 – 在開始優化之前,確認您的細胞表達了目標抗原。這似乎很簡單,但真的有許多研究人員忘了做個簡單的western blot,而直接跳到免疫熒光染色。
        Tip #2 – 優化緩沖液,這方面往往被人忽視。在固定和透化之后,孵育和洗滌過程中要用到緩沖液,而使用正確的緩沖液會對信號強度產生很大的影響。大多數研究人員都使用PBS,但有些緩沖液(如PHEM或CSK)在較低pH值下使用,可能對細胞骨架或細胞質抗原有幫助。  

2. 固定
        在所有的孵育和洗滌過程中,讓細胞盡可能地保持完整,這有點棘手,也非常關鍵。固定是維持細胞結構的關鍵一步。市場上出售的許多一抗都經過某種固定劑的驗證,但新的抗體則需要反復優化。  
        目前有兩類固定劑可供選擇:醛類固定劑和有機溶劑。醛類固定劑讓細胞骨架和膜上的蛋白互相交聯,因此是標記這些結構中的抗原的首選方法。然而,這種方法可能對蛋白進行化學修飾并遮蔽它們,使得檢測更加困難。基于甲醛的Image-iT? Fixation/Permeabilization Kit就是個不錯的選擇,它適用于大多數細胞類型。有機溶劑,如甲醇、乙醇和丙酮,不會通過交聯而改變蛋白,但它們使蛋白變性和沉淀。對于那些深藏不露的抗原,比如細胞核中的,這種方法可能還不錯。
        Tip #3 – 不要使用有機溶劑來固定那些含有熒光蛋白標簽的細胞。這可能會使標記的融合蛋白變性,而沒有信號。  
        Tip #4 – 對抗固定劑誘導的自發熒光。一些樣品容易因固定劑誘導而產生自發熒光,這可以通過醛基的還原來緩解。戊二醛在自發熒光上特別糟糕。
        Tip #5 – 可能需要抗原修復。如果抗原被遮蔽,它往往可通過熱、壓力或檸檬酸鹽緩沖液處理來修復。這些方法已經很成熟,而有些抗體會推薦一種方法。  

3. 透化
        透化能幫助抗體穿過細胞膜,進入固定細胞的內部。目前有許多不同的去污劑,能用于細胞透化,包括NP-40、Triton X-100、Tween-20和皂素等。  
透化的程度需要取決于抗原的位置。例如,如果您的目的蛋白位于細胞膜或細胞外基質中,您可能不需要太多的透化。不過,對于細胞間的目標,需要透化才能讓抗體達到抗原。時間和濃度都需要優化,不過也可以試試Image-iT? Fixation/Permeabilization Kit。
        Tip #6 – 優化您的固定和透化方法。嘗試一下不同的化合物,以及不同的時間和濃度。您也要尋找狀況良好的細胞或組織,以及特異的染料。有時,查查文獻,說不定有用。


4. 封閉  
        封閉抗體的非特異結合,將改善免疫熒光染色的結果。牛血清白蛋白和熱滅活的血清可作為非特異性的封閉劑,不過市場上也有一些商業化的產品,如BlockAid? Blocking Solution。在抗體孵育之前,加入封閉溶液。
        Tip #7 – 仔細選擇封閉溶液。不要選擇與一抗同一物種的血清哦。  
        Tip #8 – 可能需要其他的封閉溶液。因染料電荷而引起的非特異性結合可通過Image-iT FX Signal Enhancer來阻斷。而一些細胞和組織中常見的內源性過氧化物酶、磷酸酶或生物素,則需要特殊的方法來封閉。


5. 抗體孵育  
        真正的檢測步驟包括用一抗以及染料標記的二抗孵育細胞或組織。同樣,終濃度和孵育時間都必須精心優化,對于培養細胞的顯微鏡觀察,通常為0.5-10 μg/mL,室溫下30-60分鐘。多個一抗可在同一步驟中混合使用。
        一抗的檢測還必須有一個染料標記的二抗,它針對一抗的宿主物種。在使用多個一抗時,要確保不同的二抗經過其他物種的交叉吸附,以免造成信號混亂。當然,染料要與濾光片匹配,而且最好是明亮又穩定的,如Alexa Fluor染料。  
        Tip #9 – 使用最好的一抗。這是整個過程中最重要的一部分。如果做好了,您將得到一個馬上能發表的結果。完美的抗體有著良好的親和力和特異性,您值得擁有。不過如果您自己制備,記得花時間設計好抗體。
        Tip #10 – 使用適當的對照。您需要一個無一抗(只有二抗)的對照來檢驗二抗的特異性。同時,無抗體或染料的對照可檢測自發熒光。如果使用多個一抗,記得開展單個抗體的對照實驗,以檢驗交叉標記。  


6. 封片
        一旦最后一次洗滌完成,標記好的樣品將放在成像環境中,最佳地保留染料信號。盡管放在緩沖液中的細胞也能成像,但最佳的選擇是將細胞放在抗淬滅的封片劑中,保留初始信號并減少光漂白,而且折射率足夠高,可帶來出色的分辨率。  
        Tip #11 – 選擇適合您的成像時間的抗淬滅劑。如果您馬上成像,然后丟掉玻片,抗淬滅劑可以是液態的,比如SlowFade Diamond。不過,如果您想保留這塊玻片,遲一點再成像,那么您可以選擇ProLong Diamond,它在24小時內固化。


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